Producción y purificación de la enzima n-acetilgalactosamina-6- sulfato sulfatasa humana sin péptido señal en pichia pastoris
La mucopolisacaridosis IV A (enfermedad de Morquio A) es causada por la deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS). Actualmente no se cuenta con un tratamiento específico para este desorden y una de las principales opciones de tratamiento es la terapia de reemplazo en...
| Autor Principal: | Sánchez Ladino, Jhonnathan Alexander |
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| Formato: | bachelorThesis |
| Publicado: |
Pontificia Universidad Javeriana
2015
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| Materias: | |
| Acceso en línea: |
http://hdl.handle.net/10554/11842 |
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| Sumario: |
La mucopolisacaridosis IV A (enfermedad de Morquio A) es causada por la deficiencia de la enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS). Actualmente no se cuenta con un tratamiento específico para este desorden y una de las principales opciones de tratamiento es la terapia de reemplazo enzimático, empleando una enzima recombinante. En este estudio se realizó la producción y purificación de la enzima recombinante GALNS en Pichia pastoris GS115. El gen de GALNS, sin la secuencia codificante para el péptido señal (GALNSnsp), fue insertado en el plásmido pPIC9 y usado para transformar P. pastoris GS115. Los clones obtenidos fueron evaluados a 10 mL y aquellos con mejor actividad fueron escalados a 100 mL y 1,65 L. La inducción de la expresión se realizó con 0,5% v/v de metanol y el seguimiento de la enzima se realizó por actividad enzimática específica, cuantificación de proteínas, ELISA y SDS-PAGE y Western-Blot. La máxima actividad enzimática a escala de 10 y 100 mL se obtuvo a las 48 horas con 0,13 U mg-1, mientras que a 1,65 L la actividad máxima se observó alrededor de las 24 h de inducción con un valor de 0,16 U mg-1. El análisis por SDS-PAGE en condiciones no reductoras mostró bandas aproximadamente de 120 KDa, peso molecular esperado para la proteína GALNS. La proteína fue purificada mediante filtración, ultrafiltración, liofilización, diálisis, cromatografías de intercambio iónico y de exclusión molecular, obteniendo un valor de 16,69 U mg-1 al final de la purificación. El rendimiento y las veces de purificación fueron de 9,7% y 645,57, respectivamente. La enzima purificada fue estable a 4°C, con un pH de máxima actividad a 5,0. Finalmente, se evaluó la capacidad de ser capturada por las células empleando cultivos de células HEK293. Estos resultados muestran por primera vez la purificación y caracterización de una sulfatasa humana producida en Pichia pastoris GS115, mostrando el potencial de esta enzima para su futuro uso en terapia de reemplazo enzimático para la enfermedad de Morquio A. |
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