EXPRESIÓN DE IDURONATO 2-SULFATO SULFATASA HUMANA RECOMBINANTE (IDShr) EN Pichia pastoris
El objetivo de este trabajo fue expresar la enzima humana iduronato 2-sulfato sulfatasa en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. La deficiencia de esta enzima causa una enfermedad denominada Síndrome de Hunter. Siete clones fueron seleccionados por PCR (10, 28, 92, 94, 144, 149 y 153) al amplif...
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El objetivo de este trabajo fue expresar la enzima humana iduronato 2-sulfato sulfatasa en la levadura metilotrófica Pichia pastoris. La deficiencia de esta enzima causa una enfermedad denominada Síndrome de Hunter. Siete clones fueron seleccionados por PCR (10, 28, 92, 94, 144, 149 y 153) al amplificar una banda de 826pb, indicativo de la presencia de la IDSh y de la orientación del fragmento. Diferentes medios de cultivo se emplearon en la fase de crecimiento (YPG, YPGli y BMGliY), la fase de inducción fue llevada a cabo cambiando el medio de crecimiento por BMMY. Una vez crecido en YPGli, los clones 10, 28, 144, 149 y 153 mostraron actividad IDS de 1.53, 2.95, 4.35, 4,07 y 4.15 nmol/h mg a las 24, 48,72 y 120h de inducción respectivamente. El clon 28 produjo 4.21nmol/h mg al crecer en YPG; sólo los clones 92 y 94 produjeron mejores actividades cuando se crecieron en BMGliY; reportando 1.62 y 1.20nmol/mg h respectivamente. La producción de la IDShr se logró en fermentador de 1l, con medio salino (MBS-sF) con el clon IDS28. El crecimiento se realizó en cultivo discontinuo utilizando glicerol (fuente de carbono y energía) hasta obtener 12.08g/l de biomasa seca. Para el paso de inducción se utilizó un cultivo alimentado con metanol (<1% (v/v)); este último sirvió como fuente de carbono y energía e indujo la expresión de IDShr actuando sobre el promotor nativo AOX1 presente en el constructo pPIC9-IDSh. La actividad específica osciló entre 25.4 y 29.36 nmol/mg h. Se destaca que el valor de referencia de nuestro laboratorio para la IDSh en plasma humano es 12.58 nmol/mg h. |
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