Evaluación de la actividad antimicrobiana de los metabolitos secundarios obtenidos por fermentación en medio liquido de una CEPA DE Aspergillus sp. nativa del Páramo de Guasca, Cundinamarca
Los hongos microscópicos son fuente de una gran diversidad de compuestos químicos, considerándoseles la fuente de más del 50% de metabolitos utilizados por la industria farmacéutica. Estos compuestos denominados metabolitos secundarios presentan estructuras químicas complejas y su función básicament...
| Autor Principal: | Daza Gómez, Giuliana Carolina |
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| Formato: | bachelorThesis |
| Publicado: |
Pontificia Universidad Javeriana
2014
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| Materias: | |
| Acceso en línea: |
http://hdl.handle.net/10554/8824 |
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| Sumario: |
Los hongos microscópicos son fuente de una gran diversidad de compuestos químicos, considerándoseles la fuente de más del 50% de metabolitos utilizados por la industria farmacéutica. Estos compuestos denominados metabolitos secundarios presentan estructuras químicas complejas y su función básicamente está relacionada con la satisfacción de necesidades secundarias de los organismos productores, proporcionando principalmente mecanismos de defensa y facilitando procesos reproductivos, generando un impacto a nivel industrial, agrícola y ambiental debido a las múltiples aplicaciones entre las que se conocen su actividad como: agentes antibacterianos, antifúngicos, reductores del colesterol, inmunosupresores, antiparasitarios, herbicidas, antitumorales, inmunosupresores, antiparasitarios y antihelmíntico. Diferentes especies de hongos aislados del páramo de Guasca, (Cundinamarca) han sido objeto de estudio en los que se ha demostrado la producción de sustancias con actividad antimicrobiana en fermentación liquida, por lo cual el objetivo principal de este estudio es detectar metabolitos secundarios que presenten actividad antimicrobiana por medio de fermentación liquida de una cepa nativa de Aspergillus sp. nativa del páramo de Guasca (Cundinamarca). Para esto se realizó la cinética de crecimiento del microorganismo en medio liquido Hanson, determinando así la trofofase e ideofase del día 0 al día 2 y del día 2 al 12 respectivamente, adicionalmente se realizaron extracciones con éter de petróleo (baja polaridad), diclorometano (mediana polaridad) y acetato de etilo (alta polaridad) para detectar la producción de metabolitos mediante CCD (cromatografías de capa fina), revelándolas con luz UV y vainillina en ácido sulfúrico concentrado, detectando presencia de metabolitos en los tres solventes. Determinados los parámetros cinéticos, se llevó a cabo la fermentación en medio liquido Hanson (10L) , a temperatura ambiente y agitación constante durante 12 días, terminada la fermentación se filtro al vacio para separar la biomasa y la fase acuosa, a la cual se le realizo extracción líquido- liquido en embudo de decantación con los mismos solventes. Adicionalmente, se realizaron dos pruebas diferentes a la fermentación y extracción con solventes orgánicos usada para la obtención de metabolitos secundarios. La primera consistió en fermentar 50mL en medio Hanson por 12 días, se centrifugó y filtró dejando únicamente la fase acuosa con la cual se realizó la técnica de difusión de disco, y finalmente se realizó la técnica de acetato-cloroformo en la cual se dejó crecer el microorganismo en agar Hanson por 12 días, se tomaron discos de agar con microorganismo crecido, a estos se le adicionaron 40mL de acetona y 40 mL de cloroformo se dejó en agitación constante y temperatura ambiente por una hora cada uno, finalmente se filtró y se recogió la fase acuosa la cual se dejó en cabina de extracción por 12 horas y se obtuvieron 43mg del compuesto. Obtenidas todas las fracciones (Diclorometano, Acetato de Etilo, Acetona-Cloroformo, fase acuosa) se realizaron pruebas de actividad antimicrobiana mediante la técnica de difusión de disco para bacterias y la técnica en difusión en placa de agar para el hongo, a una concentración de 25mg/350?L y 50mg/350?L en dimetilsulfóxido (DMSO) (excepto el extracto acetona-cloroformo el cual se evaluó a concentración de 43mg/350?L en acetona) contra bacterias Gram negativas (Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027), Gram positivas (Staphylococcus aureus ATCC 6535, Bacillus subtilis ATCC 6633) y un hongo fitopatógeno (Fusarium oxysporum) Se encontró inhibición únicamente frente a las bacterias Gram positivas, en el caso de S. aureus ATCC 6535 se observo inhibición con la fracción de acetato de etilo tanto de 25mg/350?L como con 50mg/350?L, con la fracción de diclorometano solo se detecto inhibición a los 25mg/350?L y con el ensayo acetona-cloroformo 43mg/350?L también se observo inhibición. En el caso de B. subtilis ATCC 6633 solo se observo inhibición con la fracción de diclorometano tanto de 25mg/350?L como con 50mg/350?L. Debido a esto se corrieron las fracciones de diclorometano y acetato de etilo por cromatografía de gases acoplado a detector de masas y se comparó con la base de datos del cromatografo (librerías Nist 0.5 y Willey 7), encontrándose las siguientes sustancias: 6-Methyl-2-pyrazinylmethanol, 2,3-Dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one y 4-hydroxy Benzene ethanol, a las cuales se les puede atribuir la actividad antimicrobiana. Las CCD de la curva de crecimiento permitieron detectar la producción de sustancias en el transcurso de la fermentación, de acuerdo a los valores de Rf de las sustancias comunes en los extractos que reportaron actividad, se evaluaron las bandas obtenidas en las fracciones de la curva, las bandas con los valores de Rf comunes y comportamiento similar frente a la luz UV (? corta 254nm y larga 366nm), y al revelador vainillina en ácido sulfúrico, comenzaron aparecer entre los días 3 y 15, lo que indica que son sustancias propias del metabolismo secundario. |
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